浅析Morris 水迷宫实验在小鼠行为学表现中的应用

Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)实验是1981年由Morris建立的，用强迫实验动物(大鼠、小鼠)游泳并学习寻找隐藏在水中平台的方法来测试实验动物对空间位置觉和方向觉(空间定位)的学习记忆能力。实验基本原理：鼠类天生会游泳且会本能地寻找水中的休息场所。此活动会涉及到一个复杂的学习记忆过程，鼠类会根据水池壁上的标志对其所在位置进行空间定位，目的是能成功地找到隐藏平台，最终从水中逃脱。而根据鼠类在MWM实验中的表现可以研究其对空间导航任务的信息采集和记忆能力。继而，研究者对MWM实验进行了修改，可以用来研究工作记忆、参考记忆和任务策略。

MWM实验的空间导航任务与海马结构及功能的完整性密切相关，但值得注意的是该任务的完成还依赖纹状体、基底前脑、小脑、新皮质等脑区不同脑区之间的协调合作对于该任务的完成是非常重要的。目前认为长效突触改变是MWM实验中记忆形成的神经学基础，而海马的长时程增强作用(long-term potentiation,LTP)对突触可塑性的影响最大。纹状体和MWM的固有记忆形成有关，可能控制反应灵活性和运动。基底前脑提供了海马与新皮质之间的胆碱能神经支配。小脑可以调控认知功能从而对实验产生影响。而新皮质影响小鼠在执行实验任务时对任务的规划和执行能力。

MWM由于在N-甲基天冬氨酸受体(N-methyl-d-aspartate receptor,NMDA receptor)功能研究、突触可塑性和学习能力研究上具有显著的优势,被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、药理学、毒理学、神经生物学等多个学科研究中。

1.材料与方法

1.1试剂和仪器

钛白粉、动物行为学分析系统(上海欣软信息科技有限公司）。它包括一个直径1.2m的圆形ABS水池，目标象限中央水面下0.8 cm处放置圆形隐藏逃生平台，直径9 cm,整个实验期间位置保持不变。因本实验所研究小鼠毛色分别为黑色(C57)和灰色(129Sv),将钛白粉按125g/L浓度以温水冲开以隐藏平台并令其摄像时与小鼠颜色保持鲜明对比。水池内有加热装置将水温保持在22~24℃。水池中央上方安置有摄像机，并与记录系统相联接。水迷宫系统示意图见图1。实验数据由Morris水迷宫记录和采集相关软件分析记录。

图1.水迷宫构造示意图

1.2 实验动物

健康C57小鼠19只，129Sv小鼠20只，均为雄性，10周龄，体重23~28 g。小鼠饲养在恒温(21~22℃)房间，每隔12 h光暗循环。非实验期间小鼠自由进食标准鼠粮及饮水。

1.3 实验步骤

自发明以来，研究者出于不同的实验月的建立了多种MWM实验方案,而一个最基本的MWM实验分为空间记忆采集实验和空间搜索实验两部分。实验设计时需要考虑动物性别、年龄、种属、背景及健康状态等影响因素。实验过程中，起止时间应保持一致，并保证环境因素的一致性。实验室需保持安静，实验人员不得使用香水或者其他有刺激性气味的物品。池壁标记物体的位置在同一实验中保持固定，不要随意改变实验室中物品的位置。实验人员将小鼠放入水池后，立即离开所站立的位置，防止小鼠将实验人员误认为标记物。

1.3.1 空间记忆采集实验(acquisition trial)

用于测量小鼠在水迷宫中的学习和记忆能力。实验历时6天。实验开始前半小时将小鼠置水迷宫所在房间以适应环境。每天每只小鼠训练4次，每次以半随机(semi-random)方式选择入水点(见表1),实验者将小鼠以手托起令其面向池壁，轻轻放入水中。小鼠在60s内能寻找到平台，则记录其搜寻并登上平台所需要的时间，即潜伏期(latency)。若小鼠在60s内未能找到平台，则由实验者用手将其引导至平台，潜伏期记为60s。小鼠登上平台后，让其在平台上停留30 s,以让其根据4个象限的参照物(图1,*所示)来进行空间学习和记忆，并减少小鼠紧张。每次训练完成后，用干毛巾将小鼠擦干，并用加热器将小鼠烘干，以防低体温造成的应激，每只小鼠总计训练24次。计算每天各组小鼠潜伏期、游泳距离、平均游泳速度和探索模式。

表1，水迷宫实验时小鼠的入水点

1.3.2空间探索实验(probe/retention trial)

用于测量动物对平台的空间位置的记忆能力。在第7天撤除平台，随机选择一个入水点，将小鼠置于水中，游泳60s,期间测量：(1)目标象限(target quadrant,即原平台所在象限)滞留时间占总时间百分比；(2)游泳路程；(3)平均游泳速度；(4)搜索策略。

目前最常用的是C57和129Sv小鼠为例，应用MWM实验比较两者在空间学习和记忆中的行为学差异。

2.结果

2.1水迷宫实验数据的统计分析

进行统计分析，使用One way ANOVA方法统计，并作图。数据表示为均数士标准误。

2.2空间记忆采集实验

经过6天的训练，两个鼠种寻找平台的潜伏期明显缩短，从训练的第2天起C57潜伏期显著低于129Sv小鼠(图2A)。游泳总路程越来越短(图2B)。而两者平均游泳速度也呈降低趋势(图2C)。小鼠在目标象限滞留时间占总时间百分比随实验时间增长而增加(图2D)。

2.3空间探索实验

小鼠对平台搜索一般可分为三种策略

• 空间策略(spatial strategy);

• 系统搜索策略(non-spatial sys-tematic strategy);

• 重复环绕策略(repetitive loopingstrategy)。

空间策略是指小鼠直接游向平台、最多用一圈路程便游向平台或者直接游向目标象限的模式。系统非空间搜索策略指的是小鼠系统地搜索水池而没有对目标象限的清晰空间定位，属于一种“地毯式”搜索。而重复环绕策略是指小鼠不停地以环状轨迹沿着水池边游泳的模式来搜索平台。小鼠游泳轨迹通过软件可作搜索策略分类，两个鼠种每天搜索策略占总策略的百分比分布图分别见图3A、图3B。

对7天内小鼠所有的搜索策略统计(图4)可见129Sv以重复环绕策略为主，而C57以空间策略为主，两者之间有显著差异(P<0.01)。

两者典型搜索轨迹分別见图3C、图3D。平台穿越次数(图5A)是一个MWM常用的评分指标，两个鼠种间无明显差异。目标象限时间占总搜索时间百分比见图5B,129Sv小鼠显著高于C57小鼠。而C57小鼠总游泳路程及平均游泳速度显著高于129Sv小鼠。

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